Hætturin til litmáting og litmáting við ELISA

(1) litframleiðsla

Kromogen ELISA er seinasta stigið í inkubatiónsreaktionini, hesa tíðina katalyseraði ensymið litleyst undirlag til at framleiða littar vørur. Reaktiónshitin og tíðin eru framvegis tey viðurskifti, sum ávirka litmenningina. Í einum ávísum tíðarskeiði kann tað negativa holið vera litleyst, og tað positiva holið við tíðarlongd og litøking. Hóskandi hitaøking er við til at skunda undir litmenningina. Í kvantitativari áseting skal reaktiónshitin og tíðin eftir at undirlagið er lagt afturat vera nágreinilig sambært reglugerðini. Kvalitativt ásettur litur kann fremjast við stovuhita, tíðin yvirhøvur ikki nýtist at verða strangt stýrd, onkuntíð kann sambært positivu kontrollbrunninum og negativum kontrollbrunni litstøðan vera hóskandi til at stytta ella leingja reaktiónstíðina, tíðarhóskandi dóm.

Litmenningin av OPD undirlagi er sum heild ikki dýpkað eftir 20-30 minuttir av reaktión við uttandura hita ella 37 stigum , og so kann reaktiónstíðin leingjast fyri at økja um bakgrundsvirðið. OPD undirlagsvæta broytir sjálvvirkandi lit, tá hon verður útsett fyri ljósi. Litreaktiónin skal gerast í myrkri. Tá litreaktiónin er liðug, verður ein endaloysn løgd í fyri at enda reaktiónina. Eftir at OPD vøran er endað við svávulsýru, broytist liturin frá appelsingulum til brúnt gult.

TMB er ikki ávirkað av ljósi og kann setast á skurðborðið við stovuhita fyri at eygleiða úrslitini við síðureaktión. Men fyri at tryggja stabilitetin í royndarúrslitunum, er ráðiligt at lesa úrslitini rætta tíð. Eftir HRP viðgerð rakk liturin á TMB upp á umleið 40 minuttir, veikti hann síðani stigvíst, og doyvdi heilt til litleysan eftir 2 tímum. TMB endar í ymiskum loysnum. Ensymhemlarar sum natriumazid og natriumdodecylsulfat (SDS) kunnu steðga reaktiónini. Hetta slagið av terminator kann eisini gera, at tann blái litin heldur seg leingi (12-24 tímar), er ein góður terminatorur til sjónligan dóm. Harumframt fara ymiskir súrar terminatorar at broyta tað bláa til gult, tá ávísa bylgjulongdin (450nm) kann brúkast til at lesa upptøkuvirðið.

(2) litmetri

Áðrenn kolorimetri skal reint absorberandi pappír nýtast til at turka vætuna, sum er fest á botnin á plátuni, og síðani skal plátan setast rætt í kolorimetrisku rammuna á ensymstandard kolorimetrinum. Í royndini við mjúkari plátu sum burðarevni skal plátan setast í vanligu 96-hola rammuna, áðrenn litsamanbering kann gerast. Áðrenn tú leggur undirlagsloysnina til lit í, skalt tú klippa kantin á mjúku plátuni reinan, soleiðis at plátan kann sita heilt í seturkarmin.

Við kolorimetri skal nullpunktið fyrst stillast við destilleraðum vatni, og undirlagsholið (holið við undirlagsloysn, sum er lagt til uttan nakra reaktión) og blanka holið (holið við vanligum saltvatni ella tynningarevni í staðin fyri sýnið sum alla tilgongdina) skulu mátast og lesast fyri at skráseta reagensstøðuna hjá hesi royndini. Síðani kunnu blank hol nýtast til at kalibrera nullpunktið við destilleraðum vatni, og absorbansan hjá omanfyristandandi holum skal dragast frá absorbansuni hjá blankholunum, og síðani roknast út.

Úttrykkið av kolorimetriska úrslitinum er oplikal tættleiki (OD) fyrr, men absorbensa (A) verður nýtt sambært reglugerðunum, sum hava sama týdning. Vanligi úttrykkshátturin er at skriva upptøkubylgjulongdina niðast í høgra horni av bókstavinum A. Til dømis er upptøkubylgjulongdin hjá OPD 492nm, og úttrykkshátturin er "A492nm" ella "OD492nm".

(3) ensymstandard litmátari

Ensymstandardkolorimetrið verður nevnt ensymstandardtólið, vísir vanliga til ljósmátaran til at máta absorbansuna av ELISA-úrslitum. Eftir teimum ymisku sniðunum av fast burðarevni eru serlig snið til plátu, perlu og lítla royndargløs. Nógvar reagensfyritøkur veita samsvarandi ensymmerkingartól. Høvuðs avrikisvísitølini hjá ensymplátutólinum eru: lestrarferð, lestrarneyvleiki, endurtøkuføri, stig og málbart øki, linjuføri o.s.fr. Avlesturin av einum góðum mikroplátumátara er sum heild 0,001, við neyvleika ±1% og endurtøkuføri upp til 0,5%. Um til dømis A-virðið á A-holinum er 1,083, so skal tað sanna A-virðið á holinum í mun til luftina vera 1,083±0,01 (1,073~1,093). Endurtøka av mátingini fleiri ferðir, skal A-virðið vera 1,083±0,05 (1,078~1,088). Mátiøkið hjá ensymplátugreinaranum er ymiskt alt eftir, hvussu ensymplátugreinarin virkar. Markið hjá vanliga ensymplátugreinaranum er 0,000~2,000, men markið hjá nýggja ensymplátugreinaranum er víðkað til 2,900, ella enntá hægri. Eitt virði, sum fer upp um ovara mátimarkið, verður ofta víst við "*" ella "yvir" ella øðrum teknum. Ansast skal eftir muninum millum málbarda økið og linjurætta økið. Tað linjurætta økið er ofta minni enn tað málbara økið. Til dømis er mátandi økið hjá einum ávísum ensymplátutóli 0,000~2,900, meðan linjurætta økið hjá tí einans er 0,000~2,000, sum skal gevast gætur, tá ið standardkurvan verður gjørd í kvantitativum ELISA.

Ensymmerkingartólið skal ikki setast undir sólarljós ella sterka ljósbestráling. Stovuhitin skal vera 15~30 stig undir rakstrinum. Tólið skal forhitast í 15 til 30 minuttir áðrenn nýtslu, soleiðis at lestrarúrslitini eru meira støðug.

Tá A-virðið verður mátað, skal tann viðkvæmi upptøkutoppurin á vøruni veljast. Til dømis brúkar OPD bylgjulongdina 492nm. Fyrsta ferðin er við optimalu bylgjulongdini (W1) og seinna ferðin er við óviðkvæmu bylgjulongdini (W2). Støðan á ELISA-plátuni er ikki flutt millum tær báðar mátingarnar. Til dømis brúkar OPD 492nm sum W1 og 630nm sum W2, og endaliga mátaða A-virðið er munurin á teimum báðum (W1-W2). Dupult bylgjulongdavlesing kann minka um ljóstrupulleikarnar, sum standast av rispum ella fingramerkjum á ílatinum.